24 сентября журнал mBio опубликовал работу большой группы ученых с туманным названием «Длинная некодирующая РНК HEAL регулирует репликацию ВИЧ-1 посредством эпигенетической регуляции промотора ВИЧ-1». Специализированные и не очень СМИ дежурно отрапортовали о том, что у ВИЧ обнаружена новая уязвимость, которая вот теперь точно позволит, наконец…

Попробуем разобраться в том, что же произошло, произошло ли, и есть ли шансы на то, что у истории будет продолжение, а не будет так, как вышло с белком α4β7, который прогремел в 2016 году, но на днях три команды отчитались на страницах Nature, что там переворота точно не будет – не смогли воспроизвести первичное исследование, но смогли найти в нем фатальные ошибки.

Далее речь пойдет о некодирующих РНК, потому кратко о них. Кто не так давно учился в школе или является счастливым обладателем цепкой памяти, помнит наверняка вопросы из школьной программы: «Опишите подробно процессы по схеме ДНК(ген) →м-РНК →белок». Однако приличная часть нашего генома кодирует РНК без белкового будущего, точнее – больша́я часть нашего генома. Non-coding RNA, ncRNA — молекулы РНК, которые не транслируются в белки. Раньше их называли обобщенно smRNA, small RNA – малыми РНК, но потом нашли точно такие же, но длиной в 200 и более нуклеотидов, и решили в названии говорить о другом признаке – они не кодируют белки (потом выяснили, что часть все же кодирует или может кодировать белки, но переименовывать назад не стали).

Некодирующие РНК включают в себя многие подтипы, сегодня выделяют с десяток, и, возможно, это не финал. Не очень понятно, сколько их всего, но счет идет на десятки тысяч – называются цифры от 20 до 100 тысяч, и когда разброс такой большой, мы понимаем, что еще непременно будут уточнения. Какова их функция? Общей функции точно нет. Преимущественно они регулируют информационный поток от ДНК к белку, который, как известно, реализует функцию. Кстати, иногда не к тому белку, что нужно, и вызывают заболевания. Иногда они просто мусор, артефакт, не имеющий биологической функции. Преимущественно же мы понятия не имеем о функциях тысяч этих РНК, большая часть из которых толком и не описана.

В данной истории нас интересуют длинные некодирующие РНК (lncRNA). Первые находки, которые дали основания считать, что ncRNA, и в том числе lncRNA, могут как-то участвовать в репликации ВИЧ, произошли недавно – все ключевые работы в этой области датированы последним десятилетием. Мы знаем, что различные ncRNA характерны разным тканям, видам и подвидам клеток, их появление и исчезновение также может быть обусловлено какими-то сиюминутными потребностями клетки, являться ответом на какие-то внутренние и внешние события клетки. Было бы странно, если бы вирусы, которые с нами весь наш эволюционный путь, «не заметили» и не стали бы эксплуатировать наш геном в том числе и в части ncRNA, включая и lncRNA. И раз так, это уже направление для поиска, чем и занялась большая команда из Калифорнийского университета в Сан-Диего.

Если ВИЧ нуждается в каких-то lncRNA, то там, где он реплицирует, должны быть такие lncRNA. Из двух баз данных взяли последовательности всех известных на сегодня lncRNA – 1703 последовательности из базы Ensembl и 2915 транскриптов из базы Havana. Для исследования был разработан и реализован специализированный микрочип, а для анализа было разработано умопомрачительное количество зондов, не считая 26000 тех, что доступны на рынке, также были использованы различные изоляты ВИЧ и многочисленные специализированные клеточные культуры. При такой подготовке без «улова» уйти невозможно.

Было «поймано с поличным» пять lncRNA, экспрессия которых при репликации ВИЧ менялась самым существенным образом. По ряду причин особое внимание привлекала одна из них – linc02574-201. В Т-клетках при репликации ВИЧ что-то явно происходило не без linc02574-201. Были проведены эксперименты, чтобы исключить влияние TNF-α на экспрессию linc02574-201 – нет, процесс воспаления, видимо, тут не при чем.

С этого момента linc02574-201 получает собственное говорящее название «HEAL» от HIV-1-enhanced lncRNA (усиливающая ВИЧ-1 длинная некодирующая РНК).

Чтобы понять, что это точно работает, следует это сломать. Была исследована репликация в T-лимфоцитах, где экспрессию HEAL блокировали тремя, для надежности, специально подобранными малыми РНК (shRNA), блокирующими разные области HEAL. Для исключения случайностей, HEAL в другой серии опытов сломали иначе – антисмысловым олигонуклеотидом. На этом не успокоились и сломали HEAL третьим способом – отредактировав геномную последовательность, которая кодирует эту РНК. Все три стратегии вели в опытах на инфицированной культуре клеток к одному и тому же – репликация ВИЧ падала. Теперь предстояло зайти с другой стороны и проверить универсальность действия HEAL для вариантов ВИЧ с различной тропностью – X4, R5 и R5X4 с двойной тропностью. Экспрессия HEAL влияла на ВИЧ с любой тропностью.

Как мы заметили выше, экспрессия разных ncRNA может быть специфичной, касаться только определенных тканей. И тут HEAL не стала исключением, было выяснено, что эта РНК экспрессирует только в надпочечниках, скелетных мышцах и тимусе. Тимус – специализированный первичный органом лимфоидной ткани, вот еще одна ниточка ведет к ВИЧ.

Доказав, что сломанная HEAL подавляет репликацию ВИЧ, неплохо было бы доказать и обратное – то, что повышение экспрессии HEAL усилит репликацию ВИЧ. Сказано – сделано. Нашли «адрес» HEAL в геноме человека: первая хромосома, ген RP11-288L9, последовательность в 467 пар нуклеотидов. «В лоб» стимулировать экспрессию не получилось, но некоторый обходной маневр показал, что повышение экспрессии повышает и репликацию ВИЧ.

В любой большой подобной работе наступает момент, когда ученые отрывают взгляд от человека и переводят его на многострадальных обезьян, чтобы проверить ту или иную догадку. Так вышло и в этот раз. Впрочем, тут обошлось без жертв, но было выяснено, что генетический код HEAL у приматов консервативен только у шимпанзе и макак-резусов, что наталкивает на мысль о том, что эволюционно HEAL довольно «молодое» явление в геноме, а это еще один косвенный факт в пользу того, что специфичность вируса иммунодефицита для человека и наличие HEAL – тесно связанные явления. Как написали авторы исследования: «очень заманчивая мысль».

Дальнейший каскад опытов показал, что HEAL напрямую связывается с промотором ВИЧ, той последовательностью нуклеотидов в ДНК, с которой стартует процесс репликации. И если дело дошло до промотора ВИЧ, а нам известно, что в этом процессе зачастую есть и РНК-связывающий белок, то его нужно поискать. И такой белок был найден, им оказался известный ранее РНК-связывающий белок FUS. Таким образом, число мишеней увеличилось, теперь еще и FUS и рибопротеиновый комплекс HEAL-FUS.

Последовательно нашли, чем сломать белок FUS, а также комплекс HEAL-FUS, и посмотрели, будет ли влиять поломка на репликацию ВИЧ. Выяснили – нокдаун белка или комплекса снижает репликацию, а в процессе попутно установили важные детали механизмов влияния на репликацию. Дальнейшие попытки понять, как же именно HEAL регулирует репликацию ВИЧ, вывели на регуляцию комплексом HEAL-FUS циклинзависимой киназы-2 (CDK2), а регуляторная роль CDK2 в транскрипции ВИЧ была уже изучена в начале десятилетия.

Оставалось как-то приблизиться к реалиям. Была изучена экспрессия HEAL в мононуклеарах крови людей с ВИЧ-инфекцией, и уровни экспрессии согласовывались с теми, что наблюдались на лабораторных линиях Т-клеток H9 и MT4, которые использовались в опытах.

Также исследователи проверили, как поведут себя инфицированные культуры клеток, в которых репликация была подавлена антиретровирусным агентом, HEAL был «выключен» при помощи технологии CRISPR, а затем антиретровирусный агент устранялся – отскока не происходило, репликация ВИЧ не возобновлялась в течение 28 дней.

Выводы и перспективы? Открывает ли данное исследование столбовую дорогу на создание средства для окончательного решения вопроса ВИЧ-инфекции? Очевидно, что нет. При идеальном стечении обстоятельств в будущем мы имеем шансы получить агент, который, возможно, позволит у лиц со стабильной супрессией ВИЧ добиваться состояния, подобного функциональному излечению. Все то время, пока они принимают этот агент, то есть вовсе избавиться от лекарств открытие новых целей терапии не позволит.

Впрочем, пока нет никаких оснований вообще оценивать перспективы использования HEAL и комплекса HEAL-FUS. У нас нет понимания роли этого регулятора. Допустим, в клетках, инфицированных ВИЧ, сам вирус и запускает экспрессию этой РНК – не важно, исключим тимус из уравнения, но какова роль HEAL в мышечной ткани и надпочечниках, где также высок уровень данной РНК?

Впечатляющая работа, отличный пример настоящей науки XXI века, однако, прикладные перспективы данной работы оценить пока невозможно. Будем надеяться, что это исследование приведет в итоге к существенному изменению соотношения сил на поле боя с ВИЧ-инфекцией.

1. Zhao Y, Li H, Fang S. и др. NONCODE 2016: an informative and valuable data source of long non-coding RNAs. Nucleic Acids Res. 2016 Jan 4;44(D1):D203-8. PMID: 26586799.
2. Rice AP. Roles of microRNAs and long-noncoding RNAs in human immunodeficiency virus replication. Wiley Interdiscip Rev RNA. 2015 Nov-Dec;6(6):661-70. PMID: 26394053.
3. Breuer D, Kotelkin A, Ammosova T. и др. CDK2 regulates HIV-1 transcription by phosphorylation of CDK9 on serine 90. Retrovirology. 2012 Nov 9;9:94. PMID: 23140174.
4. Ti-Chun Chao, Qiong Zhang, Zhonghan Li и др. The Long Noncoding RNA HEAL Regulates HIV-1 Replication through Epigenetic Regulation of the HIV-1 Promoter. September/October 2019, Volume 10, Issue 5. e02016-19, mBio.